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引言
本文讨论湿热灭菌验证（过度杀灭）中自含式生物指示剂选用时，容易被忽视的一个法规落地衔接问题，并分析讨论其产生的原因和解决办法。
01 生物指示剂基本概念
生物指示剂是一种对特定灭菌程序有确定及稳定耐受性的特殊活微生物制成品，可用于灭菌设备的性能确认，特定物品的灭菌工艺研发、建立、验证，生产过程灭菌效果的监控，也可用于隔离系统和无菌洁净室除菌效果的验证评估等。生物指示剂分为载体型生物指示剂、芽孢悬液生物指示剂、自含式生物指示剂。（参：中国药典2020年版 第四部 9207）
不同类别生物指示剂示例生物指示剂的主要质量参数包括总芽孢数（N0）、DT值、存活时间、杀灭时间。D值是指将试验微生物杀灭90%所需的灭菌时间或灭菌剂量（参：中国药典2020年版 第四部 9208）。也即在基础温度下减少一个Log菌数所需的时间。
图1 常见的商业化自含式生物指示剂组成每一支热塑性小培养管中含有带细菌孢子的滤纸片和密封的玻璃安瓿。安瓿中装特殊配方的培养基，灭菌后阴性显紫色、阳性显黄色。简单实用，便于追溯管理。
02 问题析出
灭菌验证分两部分内容，一是物理验证，如热穿透、热分布等验证；二是生物验证，即以实际的微生物杀灭情况来验证灭菌程序的适用性。考虑到技术难度、重现性和可追溯性等问题，目前GMP车间使用较为广泛的为自含式生物指示剂。灭菌验证时，将生物指示剂放置于灭菌柜的不同位置，之后取出进行培养，观察颜色变化即可。操作简单，结果准确可靠。商业化的生物指示剂会给出D值和N0值，其中的N0值即为微生物接种量（初始芽孢数）。
1.指导原则相关要求与计算结果
2021年颁布《化学药品注射剂灭菌和无菌工艺研究及验证指导原则（试行）》[1]
中附件2 生物指示剂的接种量（即初始芽孢数）的计算方法：
LgN0=F（T,Z）/DT+lgNT 式（1）
公式中，
F（T,Z）——在规定的温度系数（Z值）下，灭菌工艺期望获得的温度T/℃下的等效灭菌时间，min；
DT——生物指示剂在温度T/℃下的来了参数，min；
N0——灭菌前生物指示剂的初始芽孢数；
NT——灭菌后生物指示剂的存活芽孢数；
并论述了推荐参数
一般在灭菌验证时，要求灭菌后所有生物指示剂为阴性结果（即全部杀灭），则NT实际能够达到10E-1~10E-2，甚至更低。但是，为了增加灭菌保障的安全边际，一般取NT=1，即lgNT=0。以上公示中，当生物指示剂确定后，其DT可确定，灭菌工艺确定后，所期望的灭菌值F（T,Z）可确定，lgNT取0，则可计算N0。特殊情况下，若选取NT＜1计算N0，应提供合理说明。
根据该公式（1），代入推荐参数，
得：
LgN0=F（T,Z）/DT 式（2）
即得：
N0=10E（F（T,Z）/DT） 式（3），（由于没法编辑上标，用10E**代表方次）
其中，F（T,Z）在湿热灭菌条件下，F0≥12，取12进行计算；
得：
N0=10E（12/DT） 式（4）
根据式（4），代入典型DT值进行计算
得：
计算结果①：当DT为1.5时，N0=10E8；即100×10E6；
计算结果②：当DT为1.8时，N0=10E6.7，即5.0×10E6；
计算结果③：当DT为2.0时，N0=10E6，即1.0×10E6；
计算结果④：当DT为3.0时，N0=10E4，即1.0×10E4。
2.法规与实践的冲突
目前很多注射剂（水针、大输液）企业的灭菌验证（生物）部分普遍采用商业化的自含式生物指示剂，其关键质量指标：D值在1.5~1.8min，孢子量在3.0×10E6cfu以下。
图2 截图 商品化自含式生物指示剂N0、D当使用上表A（进口）时，D值为1.84时，代入式（4），初始孢子量N0应在1012/1.84=106.52≈3.3×10E6，而实际标示值为2.3×10E6，显然，实际使用N0值小于理论计算N0值了。
当使用上表B（国产）时、D值为1.86时，代入式（4），初始孢子量N0应在1012/1.86=106.45≈2.8×10E6，实际标示值为3.0×10E6，符合要求。
当使用上表C（国产）时、D值为1.90时，代入式（4），初始孢子量N0应在1012/1.90=106.32≈2.8×10E6，实际标示值为1.7×10E6，不符合要求。
虽然B（国产）符合要求，但是从有效数字的角度，A（进口）和B（国产）的D值均为1.8，代入式（4），N0值应在5.0×10E6水平，实际都不符合理论数值要求。
另据多方调研了解，截止目前，国内多数甚至是大型制药企业的注射剂灭菌验证用生物指示剂使用都存在上述问题！
03 原因及解决办法
1.原因分析
1.1法规衔接
2020版药典在灭菌生物指示剂方面做出了重大修订，推出两个新的生物指示剂指导原则，紧跟美国欧盟等药典及协作组织的要求，已然是很大的进步，但以实例来出具要求，过于宽泛。中国药典2020年版 第四部 9207 《灭菌用生物指示剂指导原则》表1如下：
中国药典2020年版 第四部 9207实例中，湿热灭菌（121℃）给定的D值范围为1.5~3.0min，芽孢数范围在1.0×10E5~5.0×10E6；另外，其下还给了一段论述：“。。。在湿热灭菌工艺中，生物指示剂的使用是通过生物学的方法来验证其灭菌效果，只要D值足够，即使初始微生物数量低于10E6，使用生物指示剂仍然可以验证其灭菌效果。。。”
2021年颁布的注射剂无菌/灭菌验证指导原则对灭菌后残余孢子量提出了具体且严格的要求（NT=1），但药典并未收载计算公式和参数要求，两者衔接不明确。
1.2技术实践
国内试剂企业依药典范围开发了很多自含式生物指示剂，根据药典论述，自含式生物指示剂耐受性（D值）取决于整个系统（安瓿管、微孔盖、载菌试纸、培养基等），如何让D值稳定并升高；如何让N0值持久稳定在10E6以上水平（即提高初始芽孢量和长期稳定性），仍旧需要攻克大量技术难点。
另外，该指导原则的适用范围为注射剂申请上市和上市后变更，并不包括车间的常规再验证工作。生产企业照本（药典）宣科，将D值和N0值割裂开来理解，各参数在其范围即投入验证使用。新品注册时，也是惯性考虑，并未根据指导原则要求（含附件公式等）评估适用风险，生产和注册要求脱节。
2.解决办法
应充分理解生物指示剂关键质量参数的内在关联，重视指导原则在新品注册或变更研究中的指导作用，及时更新灭菌用自含式生物指示剂的应用标准。如，采用进口DT在2.0、N0在10E6以上级别的自含式生物指示剂。
GMP生产常规再验证中，如果生物指示剂依旧使用图2中的低值试剂，应充分评估其风险并出具报告，确定是否适用。注意，本文只讨论了过度杀灭的情形（F0≥12），如采用残存概率法灭菌时，上述图2 中的生物指示剂并非不能使用。
04 小结
本文介绍了湿热灭菌用生物指示剂及其关键质量指标（N0、DT）的基本概念和相互关系，并依据指导原则推荐参数，简化公式，推算数据。基于该数据明确目前企业常用的商业化自含式生物指示剂在湿热过度灭菌中运用时，关键质量指标不符合要求的问题。简要分析了其产生原因并推荐了一些解决办法。
附：基本概念
Biological indicators: Biological indicators consist of spores in or on a carrier, sometimes (as in the case ofself-contained BIs): accompanied by incubation media. Biological indicators provide the only direct measure of the lethality of the sterilization process. (AAMI ST79)
D值：在基础温度下减少一个Log菌数所需的时间，就是在一定温度下，将微生物杀灭90％（即下降一个对数单位）所需的时间（min）。D值是微生物的耐热参数，不同的微生物在不同条件下有不同的D值。
Z值：系指使某一种微生物的D值下降一个对数单位时，灭菌温度应升高的度数（℃）；
F0值：在湿热灭菌中，参比温度规定为121℃，以嗜热脂肪芽孢杆菌为生物指示剂的Z值为10℃，即F0值为一定杀菌温度T下Z值为10℃时所产生的灭菌效率与121℃、Z值为10℃所产生的灭菌效率相同时所相当的时间Min。也就是说F0值是将各种灭菌温度的灭菌效果转换为121℃灭菌的等效值。
F0=ΔtΣ10(T-121/Z)
Δt 温度T下测试的间隔时间；
T 是产品灭菌时间t的温度；
Z 是温度系数。
ATCC7953：市售的生物指示剂产品大都采用来源于美国典型微生物菌种保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）菌株。7953为嗜热脂肪地芽胞杆菌
参考文献
往期回顾
化药3类是否开展验证性临床试验的上政与下策（注24）
A和I类原辅包的细化分类情形及在立项避“坑”中的运用（注38）
“跑流程”、“一批四附”——药品注册工作中的两个实用概念介绍（注39）
讲原则：问答式+勾画版《经口吸入制剂仿制药生物等效性研究指导原则》
《药品注册管理办法》精讲01
药品注册工具：Excel函数在药品注册审评时限计算中的运用（注37）
《重组<药品注册管理办法>》之电子申报“光盘行动”的历史与实施要点（注36）
重组《药品注册管理办法》之文件管理和作业（注33）
药品研发注册与二十四节气、卦象、六十甲子的关系（注11）