本文来源：类器官学社
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文章介绍
2022年11月，美国研究者在期刊Nature Protocols（IF:14.8000）发表了一篇题为“Interrogation of the mammalian gut-brain axis using LC-MS/MS-based targeted metabolomics with in vitro bacterial and organoid cultures and in vivo gnotobiotic mouse models”的研究文章。
主要是采用体外（类器官）和体内小鼠模型系统来分析代谢物，研究微生物在肠道定植和大脑神经递质之间的联系。结果表明，微生物有选择性地影响肠-脑轴的神经递质。
实验步骤
第 1 阶段：在 ZMB1 培养基中培养厌氧细菌并收集细菌代谢物 ● 时间约 18 小时
关键步骤：需要厌氧室和微生物培养技术来培养许多共生肠道细菌。强烈建议咨询微生物学家。所有细菌培养工作都必须获得机构生物安全委员会的批准，并符合各研究机构制定的指导方针。
1、将 MRS 琼脂中的 B. dentium ATCC 27678 单菌落接种到 5 mL MRS 生长培养基中。 将 BHIS 琼脂中的 B. ovatus ATCC 8483 单菌落接种到 5 mL 的 BHIS 生长培养基中。 在厌氧工作站（AS-580 无手套厌氧室，5% CO2、5% H2、90% N2）中于 37°C 孵育两种细菌过夜。
关键：每个目标菌株使用三种以上的独立培养物。
2、第二天，在显微镜下检查细菌生长情况以确认细菌形态。
3、在室温下以 5,000g 离心 5 分钟，沉淀细菌。
4、在厌氧室中工作，弃去上清液，并将沉淀悬浮在 10 mL 厌氧无菌 PBS 中，洗去任何残留培养基。
5、在室温下以 5,000g 离心 5 分钟，沉淀细菌。
6、在厌氧室中工作，弃去上清液并将沉淀悬浮在 5 mL 厌氧无菌 PBS 中。
7、使用分光光度计测量菌悬液的 OD600nm，并计算体积，在 10 mL 新培养基中制备 OD600nm = 0.1 的菌悬液。
8、将适当体积的培养物添加到含有 10 mL 厌氧 ZMB1 化学成分确定培养基的新管中（表 5）。
9、在厌氧工作站中 37 °C 孵育 16 小时。
10、使用分光光度计测量并记录细菌悬浮液的 OD600nm。
11、在室温下以 5,000g 离心 5 分钟，沉淀细菌。
12、将无细胞条件培养基（即上清液）收集到新的 15 mL 收集管中。
13、丢弃细菌沉淀。
14、使用 0.2 μm 过滤器和 20 mL 注射器对无细胞条件培养基进行过滤灭菌。
暂停点：在进行 LC-MS/MS 分析的下游样品制备之前，储存在 -80°C （无细胞微生物条件培养基样品的 SCFA 分析见步骤 87A(i-v)；无细胞微生物条件培养基样品的谷氨酸循环和色氨酸或酪氨酸途径分析见步骤 87B(i-iii)）。
准备细菌或粪便进行定植
15、将 MRS 琼脂中的 B. dentium ATCC 27678 单菌落接种到 10 mL MRS 生长培养基中。 将 BHIS 琼脂中的 B. ovatus ATCC 8483 单菌落接种到 10 mL BHIS 生长培养基中。 将两种细菌在 37°C 厌氧条件下孵育过夜。
16、在室温下以 5,000g 离心 5 分钟，沉淀细菌。
17、用无菌厌氧 PBS 清洗细菌沉淀 3 次，除去残留培养基。
18、清洗后，将细菌以 3.0 × 108 CFU/mL 重悬于无菌厌氧 PBS 中。
19、保持培养物厌氧，直至给予小鼠（参见步骤 50）。
关键步骤：在制备好微生物后 3 小时内将其提供给 GF 机构的工作人员，由其对小鼠进行口服灌胃。
20、要准备用于重新标准化 GF 小鼠的材料，称取 0.1 g 小鼠粪便（来自与 GF 小鼠品系相同的性别和年龄匹配的 SPF 小鼠）并添加 1 mL PBS。
21、用组织杵匀浆，直至粪便在 PBS 中完全复溶。
22、涡旋混合。
23、通过在室温下以 500g 离心 5 分钟，将将废弃物沉淀。
24、将上清液转移至新的无菌管中，厌氧保存样品直至给小鼠用药（参见步骤 50）。
第 2 阶段：肠道类器官显微注射 ● 时间约 1–2 小时
至关重要：类器官的显微注射需要卵母细胞注射器。
制备类器官
25、对于显微注射，在分裂后将类器官接种到经过组织培养处理的小细胞培养皿的不同象限中的 30 μL 基质胶（每个基质胶圆顶约 20 个类器官）中。
关键步骤：一个培养皿中可放置多个基质胶圆顶。根据实验需要选择合适数量的培养皿（每种无微生物细胞条件培养基可选择两个以上的培养皿）。
关键步骤：也可使用四孔或八孔玻璃室载玻片。
关键步骤：本方案可用于从所有肠道区域分离的器官组织。
26、在37°C，5%CO2 条件下于肠道类器官培养基中培养2天，然后改为在肠道类器官分化培养基中培育4-5天。
显微注射器设置和显微注射
27、用 70% 乙醇或其他消毒剂清洁显微注射区域。
28、检查显微注射器，将其调整到靠近解剖镜的位置，以便于控制和调整。
关键步骤：显微操作器应固定在铁板上。
29、在 Sutter P30 上拉一根玻璃毛细管并在显微镜下检查。用菱形笔尖轻轻折断针头末端。
关键步骤：对于类器官注射，如果针尖非常锋利，则注射会更容易。
30、使用 MicroFil 注射器针头向毛细管回注碳氟化合物油，并将其安装到喷射器上。
关键步骤：在继续注油的同时缓慢抽出针头，避免产生气泡。
31、将注满油的毛细管针安装在显微注射器上后，按下注射器上的“排空”按钮几秒钟以排出一些油。
32、将几小片封口膜放入培养皿中，用移液器吸头压入封口膜，并等分约 100 µL 步骤 14 中的无细胞微生物条件培养基 (ZMB1)。
33、将含有等分无细胞的培养皿放入培养皿中 将微生物条件培养基放在解剖显微镜上，并通过肉眼将针放置在其上。
34、在显微镜下检查针的方向，确保针能够进入液滴。
35、使用显微操作器，将针调整到无细胞微生物条件培养基中，然后按显微注射器上的“填充”按钮。
36、将样品注入针头的一半。应该清楚地看到无细胞微生物条件培养基和油之间的区别。
关键步骤：检查是否有气泡。 如果观察到气泡，请清空针头并再次填充。
37、填充后，将针头从液滴中抽出，按下“注射”按钮几秒钟，直到样品从针头中流出。
关键步骤：在一张保鲜膜上进行此步骤，以防样品滴落。每次注射只能注入 16.7 nL 样品，因此从针头流出的样品不应太多。请勿尝试清洁注射针，因为这可能会损坏针尖。
38、将类器官培养皿放在解剖镜上，将显微操纵器定位，使毛细管针头朝下指向培养皿。
39、确保通过显微镜目镜（1.5-2.0 倍放大率）观察时可以看到针头。
40、将显微注射定位在相对于显微镜平台大于 45° 的角度。
41、使用显微操作器，将针慢慢推向类器官。
42、将针头轻轻插入一个类器官，然后按下 "注射 "按钮。这将向类器官注入 16.7 nL 样品。
关键步骤：当针尖进入类器官时，您会注意到针尖处类器官的轻微视觉变形。小心操作，避免毛细管针头撞到培养皿底部而折断。
43、使用显微操作器将针头从类器官中拔出，然后重复操作，直到所有类器官都注射完毕。
44、显微注射所有类器官后，更换新鲜培养基。这确保了从类器官外部去除任何无细胞微生物条件培养基。
45、在类器官培养基中再加入 4% 的抗生素/抗真菌剂，以确保不会发生微生物污染。
46、将注射了无细胞微生物条件培养基的类器官在 37 °C 和 5% CO2 下孵育过夜（16-20 小时）。
47、第二天，用移液管移去上清液，并转移到无菌管中。
暂停点：在进行 LC-MS/MS 分析的下游样品制备之前，保存在 -80°C 温度下（见步骤 87B(i-iii)，用于谷氨酸循环和类器官培养基样品的色氨酸或酪氨酸途径分析）。
第 3 阶段：生殖小鼠的产生 ● 时间约 17 天
至关重要：必须有 GF 小鼠设施来进行无菌实验。动物护理和实验程序必须经 IACUC 批准，并符合美国规定的所有准则，或在美国境外工作时的类似监管准则。
48、从您所在机构的 GF 动物设施或商业公司（例如 Taconic、Jackson Laboratory）购买 GF 小鼠。
关键步骤：为了控制潜在的性别差异，包括相同数量的雄性和雌性小鼠。
49、根据动物设施政策，在 GF 或无菌条件下将小鼠饲养在隔离器中，可自由获取辐照食物和水。
50、若要对 GF 小鼠进行单一分离，请指示 GF 设施的技术人员给每只小鼠口服 200 µL 悬浮在无菌厌氧 PBS 中的细菌（3.0 × 108 CFU/mL；来自步骤 19）或悬浮在无菌厌氧 PBS 中的粪便微生物（来自步骤 24）。
关键步骤：根据我们之前的工作，1 次口服管饲足以实现大多数微生物的单一结合。 此外，对于新生小鼠，较小的口服量（20 µL）也是可以接受的。
51、将小鼠维持在无菌环境和 GF 隔离箱中饲养 17 天。
关键步骤：小鼠可以在无菌隔离箱中饲养的时间可长可短。过试验研究确定实验的最佳时间点。
52、通过将收集的粪便样本铺在 MRS、BHI 和血琼脂上来监测实验过程中的动物状态。 在 37°C 需氧和厌氧条件下孵育板，并在 24 和 48 小时检查生长情况。
无菌样本采集
至关重要：一旦无菌动物和 GF 动物从设施中转移出来，它们就有可能暴露于环境微生物。 我们建议在动物转移后尽快对动物实施安乐死并收集样本。 另外，一些 GF 动物设施设有尸检室，这将有助于避免转移过程中潜在的污染。
53、为了收集样本，将小鼠从无菌隔离箱转移到附属设施。
54、到达设施后，将小鼠转移到无菌生物安全柜中。
55、收集粪便时，用手牢牢抓住小鼠，将粪便收集到贴有标签的 1.5 毫升 Eppendorf 管中。
暂停点：将粪便储存在−80°C，直到可以进行代谢物提取（见步骤80-86，“粪便样本代谢物提取”）。
56、使用经批准的 IACUC 方案（CO2、异氟烷等）对小鼠实施安乐死。
关键步骤：对于脑组织采集，建议使用异氟烷以避免窒息期间代谢物的变化。
脑组织分离和代谢物提取 ● 时间约每只小鼠 15 分钟
57、要分离脑组织，请用大而锋利的剪刀从头骨后面切开，快速斩首。
58、使用细尖剪刀，沿中线剪开头皮上的皮肤，露出头骨。 沿着中线向鼻子切开头骨，轻轻地将头骨向两侧剥离以暴露大脑。
59、使用镊子快速、轻轻地取出大脑，并用冰冷的无菌 PBS 冲洗以去除血液。
60、转移至预称重的 2 mL Fastprep 管中，其中含有 0.1 g Lysing Matrix D（1.4 mm 陶瓷球）。 称重以获得组织重量。
61、添加 0.5 mL 体积的冰冷 Optima LC/MS 级甲醇。
62、将试管置于 FastPrep-24 经典台式珠打裂解系统或等效组织匀浆器上。
63、以 4 m/s 的速度均质化 20 秒，两次。
64、将样品在室温下以 500g 离心 5 分钟，以沉淀微珠和组织碎片。
65、将上清液转移至有标签的试管中。
66、将另外 0.5 mL 体积的冰冷 Optima LC/MS 级甲醇添加到含有组织的试管中。
67、重复步骤 63-64。
68、将第二体积的上清液转移至标记的管中； 现在总体积应为 1 mL，并丢弃均质组织颗粒。
69、将样品立即放入液氮中速冻。
暂停点：保存在 -80 °C，直到进行 LC-MS/ MS 分析的下游样品制备（见步骤 87B(i-iii)，谷氨酸循环和色氨酸或酪氨酸途径分析匀浆脑样品提取物）。
肠道内容物收集和代谢物提取 ● 时间约每只小鼠 15 分钟
70、用 70% 乙醇喷洒小鼠身体。
71、收集肠道样本时，在腹部切开一刀，沿小鼠右侧切开，穿过横膈膜，朝肝脏方向切开。
关键步骤：确保切开肌肉和内膜。
72、将皮肤、肌肉和内膜拉至左侧，从而暴露器官。
73、识别胃（肝脏下方）并在幽门括约肌处切开肠道。
74、用镊子向上拉，小肠就会与结缔组织和血管断开。
75、要切除结肠，请将盲肠和结肠与腹部脂肪断开，并在直肠处切开结肠。
76、将肠道分成不同的部分：十二指肠、空肠、回肠和结肠。
77、使用连接到注射器的移液器吸头，用 500 µL 水将每个部分的内容物冲洗到单独的 1.5 mL Eppendorf 管中。
78、为了收集代谢物，在室温下以 300g 离心管 5 分钟以沉淀固体。
79、将上清液转移至新管中，并丢弃沉淀。
暂停点：保存在 -80 °C，直到进行 LC-MS/ MS 分析的下游样品制备（见步骤 87B(i-iii)，谷氨酸循环和色氨酸或酪氨酸途径分析匀浆脑样品提取物）。
粪便样本代谢物提取 ● 每 50 个样本约 2.5 小时
80、在开始样品提取程序之前，创建由乙腈:水 (1:1 (vol/vol)) 组成的萃取溶剂，并将萃取溶剂在冰浴中冷却至少 1 小时。
81、在 1.5 mL Eppendorf 管中称取步骤 55 中约 50 mg 的粪便颗粒。
82、记录每个粪便样本的质量，用于分析后标准化。
83、向每个样品中添加相当于 10 µL/mg 待均质组织的冰冷提取溶剂。
84、在室温下涡旋混合 5 分钟以使样品均质化。
关键步骤：可使用短暂的超声处理来分散大块粪便。
85、将样品在室温下以 16,000g 离心 5 分钟，以沉淀粪便碎片。
86、将上清液转移至新管中，并丢弃粪便颗粒。
暂停点：立即衍生SCFA分析，或将上清保存在- 80°C，直到进行LC-MS /MS分析的下游样品制备(见步骤87A(i-ii)和(vi-viii)，对均质粪便样品提取物进行SCFA分析;步骤87B(i-iii)用于谷氨酸循环，以及匀浆粪便样本提取物的色氨酸或酪氨酸途径分析)。
用于 LC-MS/MS 分析的生物样品制备
关键：在进行大型实验之前，应通过小型试点研究凭经验确定每种样品类型代谢物含量的适当稀释因子； 代谢物浓度在组织类型和治疗（即细菌单一结合）条件之间可能存在很大差异。
87、可使用选项 A 进行 SCFA 分析或选项 B 进行谷氨酸循环、色氨酸和酪氨酸途径分析，为 LC-MS 制备微生物样品。
选项A
SCFA在无细胞条件微生物培养基样品和小鼠粪便样品提取物中的衍生化 ● 制备新鲜 EDAC 和巯基乙醇溶液并衍生 100 个样品的时间约为 8 小时
至关重要：EDAC衍生化和2-巯基乙醇猝灭溶液在每次使用前都需要新鲜制备。在衍生化反应完成后，丢弃这些溶液。
(i) 在环境温度下在实验室工作台上解冻过滤灭菌的培养基样品（来自步骤 14）和提取的粪便样品（来自步骤 86）。
(ii) 用乙腈按 1:1 稀释一定体积的每种培养基样品和粪便样品提取物。
(iii) 对于培养基样品，通过混合 10 µL 体积的上一步骤中两倍稀释的培养基样品、100 µL 体积的苯胺溶液 (100 mM) 和 50 µL 体积的 EDAC 溶液来衍生 SCFA 含量 (100 mM) 在微量离心管中，然后涡旋混合每个样品 20 秒，并在 4 °C 孵育 2 小时。
(iv) 通过添加各 50 µL 体积的 2-巯基乙醇溶液 (100 mM) 和琥珀酸溶液 (250 mM) 来淬灭介质样品中的衍生反应，然后涡旋混合每个样品 20 秒并在 4 ° 下孵育 C保持2小时。
(v) 将 10 µL 体积的衍生培养基样品与 90 µL 体积的 ISS-A 溶液直接在自动进样器小瓶中混合，用于 SCFA 方法（参见“试剂设置”），并涡旋混合 520 倍- 短暂稀释样品。
(vi) 对于粪便样品提取物，通过混合 70 µL 体积的两倍稀释粪便样品提取物（来自步骤 87A(ii)）、20 µL 体积的苯胺溶液 (100 mM) 和 10 µL 体积，衍生 SCFA 含量 将 EDAC 溶液 (100 mM) 放入微量离心管中，然后涡旋混合每个样品 20 秒，并在 4°C 下孵育 2 小时。
(vii) 通过添加 12 µL 体积的 2-巯基乙醇溶液 (100 mM) 和 18.8 µL 体积的琥珀酸溶液 (250 mM) 来淬灭粪便样品提取物中的衍生反应，然后涡旋混合每个样品 20 s，并在 4°C 孵育 2 小时。
(viii) 将 10 µL 体积的衍生粪便样品与 90 µL 体积的 ISS-A 溶液直接在自动进样器小瓶中混合，用于 SCFA 方法（参见“试剂设置”），并涡旋混合 37.4 倍- 短暂稀释样品。
关键步骤：如果衍生培养基或粪便样本提取物中的 SCFA 浓度非常高 (>0.5 mM)，则可以使用乙腈:水 (2:8) 溶液进行额外 5 至 20 倍的中间稀释 (vol/vol)) 作为稀释剂，然后在 ISS-A 溶液中进行最终 10 倍稀释。
暂停点：如果 LC-MS/MS 可用性存在问题，则在完成上述步骤 87A(iv) 或 87A(vii) 中列出的淬灭程序后，含有衍生化 SCFA 的样品可冷冻保存在 -80 °C 下； 衍生培养基和提取的粪便样本已冷冻保存数周，性能没有任何损失。
选项B
无细胞条件微生物培养基、类器官培养基、肠内容物样品提取物以及匀浆小鼠粪便和脑样品提取物中谷氨酸循环、色氨酸和酪氨酸途径分析的样品处理 ● 准备 150 个样品约 4 小时
关键：谷氨酰胺和谷氨酸峰需要色谱分离以防止同位素重叠。
(i) 在环境温度下解冻过滤灭菌的培养基样品（步骤14）或类器官样品（步骤47）、提取的肠内容物样品（步骤79）、提取的粪便样品（步骤86）和匀浆的脑样品提取物（步骤69） 工作台上的温度。
(ii) 短暂涡旋样品。
(iii) 将 10 µL 体积的样品添加到 90 µL 体积的 ISS-A 溶液中，直接在自动进样器小瓶中进行适当的方法（即谷氨酸循环 ISS-A、色氨酸途径 ISS-A 或酪氨酸途径 ISS-A） ，并短暂涡旋混合。
LC-MS/MS 设置程序和系统适用性评估
88、将 LC 溶剂管线（已安装在线溶剂过滤器）转移至代谢组学方法的适当流动相中，打开吹扫阀并通过每个 LC 溶剂管线吹扫流动相至少 5 分钟，完成后关闭吹扫阀 。
89、将 NW 溶剂管线转移到适合代谢组学方法的针洗溶液中，打开吹扫阀并通过 NW 溶剂管线手动吹扫针洗溶剂（体积相当于 ~50 mL）以执行针洗溶剂更换，然后关闭吹扫 阀门完成后。
90、将适当的保护柱/分析柱对安装到 LC 流路中，并将色谱柱夹入色谱柱加热炉中。
91、打开 LC-MS/MS 系统，通过 LC 泵建立流动相流量，以平衡保护柱/分析柱对，并平衡质谱源的热组件和气流以及质谱仪的电气组件 。
92、在注入样品之前将系统平衡至少 10 分钟，并观察 LC 系统的操作背压。 如果压力太低，请检查系统是否泄漏； 如果太高，请评估系统是否存在堵塞或考虑更换保护柱、分析柱或两者（我们的 LC-MS/MS 系统的典型操作背压如下： SCFA：约 1,750 磅每平方英寸 (PSI) ；色氨酸途径：~3,000 PSI；酪氨酸途径：~2,000 PSI；谷氨酸循环：~950 PSI）。
93、对中级校准品进行五到十次重复进样，以平衡系统并检查适当的色谱保留和 MS/MS 灵敏度。 为了测试系统适用性，对每种代谢物的峰面积进行积分并计算精度 (%CV)； 序列的 CV 应<10%。
94、对最低级别的校准品进行三到五次重复进样，以确保系统在指定的进样体积下具有足够的灵敏度。 要测试系统适用性，请确保信噪比至少为 5:1，最好为 10:1。
95、通过按以下顺序重复注射以下样品来进行残留评估：
(i) 注射三到五次最高水平校准品的重复注射，以在系统中预先加载感兴趣的代谢物；
(ii) 注射三份溶剂空白样品以进行残留评估；
(iii) 执行最低水平校准品的单次进样。 为了测试系统适用性，对所有样品中的代谢物峰面积进行积分，计算第一个空白中测量的代谢物面积与最低水平校准品中测量的面积的比率，并且代谢物的面积比应≤0.20，并且≤ IS 化合物为 0.05。
96、如果根据上述评估认为系统合适，则可以将分析批次排队并注入。 如果不是，则在注入分析批次之前可能需要采取纠正措施。
97、为了原位监测 LC-MS/MS 系统性能，可以按照标题为“色氨酸途径、酪氨酸途径和谷氨酸循环方法的 QC 准备工作”和“SCFA 方法的 QC 准备工作”两节中的描述来准备 QC 样品。 在补充方法中。 QC 样品可以散布在分析批次的整个过程中，通过测量单个代谢物水平的准确性（% 偏差）和 QC 池的精度 (% CV) 来测试 LC-MS/MS 系统性能的适用性。
采集后数据分析程序
98、通过打开中高级标准品的数据文件并指定每种代谢物的色谱峰积分参数来建立定量方法，这些参数考虑： (1) 峰形和正确的峰选择； (2)保留时间； (3) 领先和落后基线水平； (4)峰高和信噪比阈值。
99、接下来，指定每个代谢物/IS 对的 SRM 转换（表 7-10）、校准曲线回归模型（即线性、二次和幂拟合）以及适当的曲线加权因子（即无、1/x 和 1/x2 ) 在软件中。
100、保存定量方法并将其应用于实验数据集，并直观地确认所有代谢物和内标化合物的峰积分的适用性。
101、为批次中包含的每个样品指定样品类型（即校准品、试剂和基质空白、QC 和未知物），并确认每个样品的适当稀释因子。
102、手动输入所有校准品和 QC 标准样品的标称浓度，并评估和确认校准曲线回归模型的适用性、校准品和 QC 的准确性和精密度以及 IS 响应一致性。
关键步骤：如果样品中特定代谢物的计算浓度远远超过最高校准品的响应，强烈建议使用更高的稀释因子重新处理样品并重新分析该代谢物。
103、保存包含代谢组结果表的文件，并将结果表导出到 Excel 以进行数据报告或组织样本提取物的后处理标准化。
104、通过均质组织密度 (mg/mL) 标准化组织提取物中的代谢物浓度。
关键步骤：对于色氨酸途径、酪氨酸途径和谷氨酸循环方法，微生物或类器官培养基样品中测量的代谢物浓度以 ng/mL 为单位，对于 SCFA 方法以 nM 为单位； 对于色氨酸途径、酪氨酸途径和谷氨酸循环方法，组织样品中测量的代谢物浓度以 ng/mg 组织为单位报告，经过适当的单位转换后，标准化 SCFA 结果以 ng/mg 组织为单位报告。
Troubleshooting
参考信息：
Interrogation of the mammalian gut-brain axis using LC-MS/MS-based targeted metabolomics with in vitro bacterial and organoid cultures and in vivo gnotobiotic mouse models.Nat Protoc
. 2023 Feb;18(2):490-529. doi: 10.1038/s41596-022-00767-7.PMID: 36352124.
本文来源：类器官学社
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