导读
LPAR1（磷脂酸受体 1）成为多种人类疾病，如纤维化症，在治疗策略中的新兴靶点。这一现象不仅凸显了开发新型 LPAR1 拮抗剂的迫切性，也突出了寻找新的化学骨架的重要性。
为了应对这一挑战，研究者进行了高通量虚拟筛选。在该过程中，他们评估了三个现有的晶体结构和一个 AlphaFold 模型，以确定这些模型在结构基础的虚拟筛选中的适用性。研究结果显示，与预测模型相比，晶体结构具有更高的可靠性。
值得一提的是，提升筛选过程的精确性并不一定能增加命中率的多样性。因此，有效的虚拟筛选不仅取决于所使用的方法，还需要考虑多种因素进行综合优化。
经过筛选，研究者确认了五种经 LPAR1 依赖的钙离子通量测定得到验证的结构。为了进一步探究蛋白质与配体间的交互作用，他们采用了多种计算技术，进行了详细的结合模式分析。
方法流程🖥️ 软硬件环境配置
- 操作系统：大多数实验使用 Windows 操作系统；分子动力学模拟使用 Linux。
- 硬件：HP EliteDesk 800 G9 TWR 工作站和 NVIDIA RTX 3080 用于分子动力学模拟。
- 软件：绝大多数任务，包括预处理、虚拟筛选和分析，使用 Schrodinger Small Molecule Drug Discovery Suite（2022-4 版本）。
- 分子动力学模拟使用 Desmond 软件，该软件也属于 Schrodinger 平台。
🧬 生成 DUD-E 数据
- DUD-E: https://dude.docking.org/
- SMILES 数据：提交了 10 种选定的化合物。
- 数据清理：从生成的列表中移除了电荷和相应的诱饵。
共生成了 510 个唯一的 SMILES，结果被加载到 Microsoft Excel 进行进一步分析。
🎯 分子对接实验流程
- 蛋白质处理：通过使用 Protein Preparation Workflow 模块和 OPLS4 力场进行能量最小化，移除了距离配体 5 Å 以外的水分子。
- 配体处理：所有配体均通过 Schrodinger 的 LigPrep 模块和 OPLS4 力场进行了准备。
- 对接盒子生成：SiteMap31 模块用于初步识别结合位点，并据此生成了相应网格。
- 配体对接：采用 Glide 软件进行了多级精度的配体对接。
- 原生配体对接：为了验证对接流程的可靠性，将共晶化的配体对接回其原有的晶体结构中。
- 虚拟筛选流程：由于配体已通过 LigPrep 模块预处理，因此跳过了配体准备步骤。
⚙️ 分子动力学模拟
- 系统设置：正交长方体盒（10 × 10 × 10 Å）与 SPC 溶剂模型。
- 力场：OPLS4
- 温度和压力：300.0 K 和 1.01325
- 模拟持续时间：100 ns
结果通过 Simulation Interactions Diagram（SID）进行了分析。
细胞内钙离子增加的检测
使用了基于 NanoBiT 的方法来检测 HEK293 细胞中细胞内钙离子水平的变化。测试了各种浓度的化合物，并记录了实时发光变化。
📊 IC50 测定的统计分析
- 软件：GraphPad Prism 8
- 方法：非线性回归分析
- 稀释：不同化合物使用四倍和两倍的串联稀释。
IC50 值是根据三次独立实验计算得出的。
主要结果及图表🧪 选取适宜的蛋白质模板至关重要
在该研究中，研究者评估了三种 LPAR1 的晶体结构（PDB IDs: 4Z34, 4Z35, 和 4Z36）以及一个 AlphaFold 模型。结构 4Z34 在虚拟筛选过程中表现最为出色。为了成功识别潜在的有效抑制剂，选取适当的蛋白质模板显得尤为关键。
📊 筛选精度对结果影响的考量
使用 Schrodinger 软件的内置虚拟筛选流程进行评估，这包括高通量虚拟筛选（HTVS）、标准精度（SP）筛选以及额外精度（XP）筛选。研究结果显示，尽管 XP 筛选消耗更多计算资源，但与 SP 筛选相比，并未显著提升筛选效能。
🎯 对筛选出的化合物进行生物活性评估
基于标准精度（SP）筛选，研究者选取了前 200 名化合物进行进一步的生物活性检测。在这些化合物中，有 5 种在 LPAR1 依赖的钙流通实验中展示了超过 50%的抑制效果。
🔄 蛋白质与配体的动力学模拟研究
研究者还进行了分子动力学模拟，以深入探究筛选出的化合物与 LPAR1 之间的相互作用。研究发现，相对于静态的晶体结构数据，动力学模拟提供了更丰富的信息，有关配体与蛋白质的相互作用。
Tips，选择适当的蛋白质模板和筛选精度是提高虚拟筛选成功率的关键因素。
图表 1：已知 LPAR1 拮抗剂
图表 2：LPAR1 依赖性钙流测定分析
- (A) 虚拟筛选获得的化合物的抑制效应，预处理浓度均为 50μM。
- (B)至(F) 剂量依赖性活性的化合物：1 号、19 号、21 号、23 号、55 号
- (G) AM095 作为阳性对照
图表 3：虚拟筛选出的前五种化合物与 AM095 的结构和性质对比
- M.W.：分子量
- MM-GBSA：分子力学结合广义 Born 和表面积溶剂模型
图表 4：含羧酸基团的化合物与蛋白-配体交互分析
- (A, E) 预测的结合构象
- (B, F) 分子对接研究揭示的蛋白-配体交互
- (C, G) RMSD 分析
- (D, H) 在 100 纳秒的分子动力学模拟中观察到的交互残基频率
图表 5：21 号化合物与蛋白-配体交互分析
- (A) 预测的结合构象
- (B) 分子对接研究揭示的蛋白-配体交互
- (C) RMSD 分析
- (D) 在 100 纳秒的分子动力学模拟中观察到的交互残基频率
图表 6：ONO-9910539 与 21 号化合物的结合模式比较
- (A) ONO-9910539 与 LPAR 交互的快照
- (B) 两种配体的三维药效团模型
- (C) ONO-9910539 的蛋白-配体交互
- (D) 两种化合物的结构比较
图表 7：19 号与 23 号化合物与蛋白-配体交互分析
- (A, E) 预测的结合构象
- (B, F) 分子对接研究揭示的蛋白-配体交互
- (C, G) RMSD 分析
- (D, H) 在 100 纳秒的分子动力学模拟中观察到的交互残基频率
图表 8：对接分数、MM-GBSA 与抑制效应的相关性研究
- (A, B) 64 种化合物的对接分数与抑制率图
- (C, D) 五种活性物质与 AM095 的 MM-GBSA 与抑制率图
- (E, F) 在 100 纳秒模拟期间五种化合物的平均结合自由能与抑制率和 IC50 值
表 1 各类蛋白质结构在对接准确性方面的评价
注释：
虚拟库筛选与分子结构：关键要素与观察结果
通过对优选的虚拟化合物库和 Isoxazole 骨架的研究，研究者发现虚拟库的规模、结构多样性以及分子对接分数与潜在抑制剂的活性之间存在复杂的关联。
📚 关于虚拟化合物库的规模与多样性
在寻求识别新的化合物骨架方面，研究者优先挑选了具有结构多样性和商业可用性的虚拟化合物库。尽管不断扩大的虚拟库引发了关于库规模是否能增加发现有潜力「命中」化合物的几率的争议，筛选更大的化学空间的重要性受多重因素制约，仍是持续的研究焦点。
🧪 Isoxazole 骨架与已知抑制剂的反应差异
出乎预料地，化合物 23 与 BMS-986020 或 Ki16425 表现出不同的结合方向。虽然目前还没有这些拮抗剂与 LPAR1 结合的晶体结构，但先前的研究已指出，这些拮抗剂的羧基酸基团与位于 N-末端的 Lys39 和 His40 等残基进行离子相互作用，这些残基具有至关重要的作用。
📈 分子对接分数与抑制剂活性的不一致性
与众多先前研究一致，分子对接分数与抑制剂活性之间并没有稳定的相关性。
🖥 DUD-E 生成的 SMILES 数据处理
研究者提交了 10 种选定化合物的 SMILES 以进行 DUD-E 生成。生成的数据被导入到 Microsoft Excel 中，随后从列表中删除了带电荷的生成形式和相应的诱饵，最终获得了总共 510 个独特的 SMILES。
讨论
本项研究运用了综合的虚拟筛选手段，不仅成功地鉴别出了全新的化学骨架，还深入探讨了与 LPAR1 拮抗剂相互作用的复杂机制。
首先，研究者发现，在虚拟筛选中，对接得分与抑制活性之间并无明确的关联性。特别是在考察对接得分与 50μM 下的百分比抑制作用时，整个样本群体中并未出现明显的相关性。相反，活性化合物中却呈现出一种反向关系。然而，MMGBSA 值与活性化合物的百分比抑制作用之间确实有一定程度的相关性。
其次，在筛选流程中，研究者识别了五种不同的化学骨架，并进一步通过 LPAR1 依赖的钙离子通量测定进行了验证。这些化合物虽然展现出较弱的抑制效果，但通过 100ns 的分子动力学模拟，研究者获得了有关结构模式和相互作用机制的重要信息。
接着，关键信息关于结构和相互作用机制从分子动力学模拟中得以收集。所有与配体有相互作用的残基都显示出低的均方根波动（RMSF）值，这表明这些残基已达到稳定状态。此外，与 Apo 形态相比，配体存在时，结合位点的均方根偏移（RMSD）值明显降低，证明了配体结合为系统带来了稳定性。
最后，研究者还计算了 100ns 模拟过程中的平均结合能量，并分析了其与实验数据的相关性。当平均结合能量与百分比抑制作用进行比较时，明显的相关性得以观察。然而，与 IC50 值相比，这一相关性并没有体现。
参考资料:
- Nguyen, L. P., Khan, R. A., Kang, S., Lee, H., Hwang, J.-I., & Kim, H.-R. (2023). Discovery of Chemical Scaffolds as Lysophosphatidic Acid Receptor 1 Antagonists: Virtual Screening, In Vitro Validation, and Molecular Dynamics Analysis. ACS Omega. https://doi.org/10.1021/acsomega.3c04798
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